2020诺奖出炉‖再次了解CRISPR/Cas9这个黑科技
2020年10月7日，诺贝尔化学奖首次同时颁发给了两位女科学家：法国Emmanuelle Charpentier和美国Jennifer A. Doudna，以表彰她们在“开发基因组编辑方法”方面做出的变革性贡献。
据了解，Emmanuelle Charpentier首先在细菌化脓性链球菌中发现了tracrRNA；2011年指出了tracrRNA是细菌古老免疫系统CRISPR/Cas的一部分；同年，Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna合作；2012年她们发表的论文中指出Cas9蛋白是双RNA引导的DNA内切酶，并首次在体外证明使用Cas9的CRISPR系统可以切割任意DNA链。同时，她们简化了基因剪刀的分子成分，创建了CRISPR/Cas9基因剪刀，使其更易于使用。后来，她们又用CRISPR/Cas9基因剪刀成功编辑了大肠杆菌的基因，证明了CRISPR/Cas9比其它类型的基因剪刀更有效和准确。
Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna的研究成果为CRISPR/Cas9技术的发展做出了核心贡献。
CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR主要有两类:第1类(包括第I、III、IV型)利用多种Cas蛋白，而第2类(第II、V、VI型)则需要单一Cas蛋白。这些Cas蛋白利用RNA引导靶向切断并降解外来入侵DNA。哺乳动物细胞中常用的用于基因编辑的Cas酶包括II型化脓性链球菌(Sp)Cas9、略小的金黄色葡萄球菌(Sa) Cas9或V型Cas12a / Cpf1。在II型CRISPR系统中，crRNA与反式激活tracrRNA形成复合物(称向导RNA，gRNA)，靶向Cas9蛋白从而切断DNA中的特定位点。
在哺乳动物细胞基因编辑应用中，gRNA中包含了一个与基因组DNA靶点互补(附近有一个前间区序列邻近基序，简称PAM)的20 bp序列，它将Cas9蛋白定位到该位点，从而在DNA中产生双链断裂(DSB)。Cas9蛋白切割后产生的DSB主要通过两种机制进行修复：一种是细胞内源性的非同源端连接修复机制(NHEJ)，可以导致小的插入或删除(indels)，或通过同源定向修复(HDR)，添加外源性模板，产生新的DNA。（图一）
根据PAM序列的不同，Cas9分为spCas9和saCas9两种。（图二）
saCas9基因序列长约3.3kb，spCas9基因序列长约4.1kb，由于saCas9的基因序列要比spCas9的基因序列短很多，所以在克隆方面，saCas9要更为容易，且saCas9更适宜包装成AAV病毒，两者也都可以包装成腺病毒和慢病毒。saCas9和spCas9另外一个很大的区别是两者识别的PAM序列不同，saCas9识别的PAM序列是5’-NNGRRT-3’,而spCas9识别的PAM序列为5’-NGG-3’,因为saCas9的PAM序列要比spCas9的PAM序列长，在基因组中出现的概率更低，相比于spCas9脱靶率要低，其gRNA设计也相对更困难。
2. CRISPR/Cas9与ZFN和TALENs的比较
CRISPR/Cas9是继ZFN和TALENs之后的第三代基因编辑技术。与前两代基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9具有低成本、高效率和简单易用等优势，因而被人们广泛应用。下表所列为ZFN、TALENs和CRISPR/Cas9三种基因编辑技术的比较。
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特性
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ZFN
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TALENs
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CRISPR/
Cas9
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序列识别组分
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蛋白-DNA
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蛋白-DNA
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RNA-DNA
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靶向效率
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特异性和效率低
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特异性和效率较低
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特异性和效率高
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成本效率
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成本高
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成本较高
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成本低
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脱靶诱变
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可变的
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低
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中等的
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设计参数
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蛋白
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蛋白
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RNA
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病毒传递
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容易
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中等
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中等
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3. CRISPR /Cas9技术的应用
利用慢病毒载体中建立单一的gRNA文库并应用于哺乳动物细胞的基因功能分析，与现有的RNA干扰文库比较，除了产生敲除而不是暂时敲除外，也降低了脱靶效应。
CRISPR/Cas9技术可精确地修改细胞和动物模型中的DNA，可能从单点突变到染色体易位，从而导致转基因细胞系和动物系统的产生。这一应用不仅对诊断有效，而且对错误插入或缺失的纠正也有效，从而成为基因治疗的一个重要方面。
研究表明，通过噬菌体传递针对细菌耐药基因设计的CRISPR/ Cas9系统，有助于靶向耐药候选菌。类似地，序列特异性抗病毒药物也在开发中，可利用CRISPR/ Cas9技术修饰参与宿主-病毒相互作用的基因。
CRISPR/Cas9系统为植物基础研究提供了宝贵的工具，也为作物改良提供了机会。CRISPR/Cas9系统可以很容易地对普通作物进行改造，有望成为植物育种的发展方向。水稻、小麦、玉米、番茄、苹果、模范豆科植物、荷花、苜蓿等均已成功转化。
• 13000余个小鼠gRNA pool克隆和350余个人源gRNA pool克隆；• 人源gRNA pool克隆均经过敲除效果验证，效果有保障；•人源基因HEK293敲除细胞系比瞬时敲除效率更高，时间更长，效果更好；
维真生物可为科研工作者提供全套CRISPR/Cas9相关服务，包括gRNA的设计与筛选、gRNA/Cas9载体构建、gRNA/Cas9病毒包装、敲除效果验证以及KO细胞系的建立。
1. 服务项目全：维真生物可以提供从gRNA序列设计、gRNA质粒构建、高效gRNA序列筛选、病毒包装和细胞系建立等多种灵活性服务，满足科研工作者不同的实验需求；2. 服务种类多：维真生物可以提供单gRNA质粒构建，多合1 gRNA质粒构建和gRNA pool & gRNA mix质粒构建；①4 gRNA mix质粒构建—— 保证有效 & 选择性多该服务是将4条gRNA序列克隆至Cas9 + gRNA all in one慢病毒质粒。该重组质粒不仅可以用于转染细胞，也可包装成慢病毒。但是，考虑到重组载体比较大对细胞转录效率的影响，我们强烈推荐您直接选择慢病毒成品。②gRNA pool质粒构建—— 编辑效率大大提高维真生物采用特殊的生产工艺针对同一基因构建gRNA pool质粒，大大提高了目的基因的编辑效率。
3. 质粒数量多：维真生物可以提供单载体、双载体；腺病毒载体、慢病毒载体和AAV 载体；不同报告基因EGFP和RFP，不同真核抗性筛选基因puro和Blat、cre功能基因质粒。
维真CRISPR/Cas9相关载体（部分）
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腺病毒载体
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慢病毒载体
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AAV载体
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维真生物建立了一套简捷和可重复的基因敲除效果检测系统——荧光法，克服了常规检测方法的弊端，操作简单、周期短、敲除效果检测不受细胞类型的限制、实验结果直观可靠！
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[1]. Young, C.S., A.D. Pyle and M.J. Spencer, CRISPR for Neuromuscular Disorders: Gene Editing and Beyond. Physiology (Bethesda), 2019. 34(5): p. 341-353.[2]. Gupta, D., et al., CRISPR-Cas9 system: A new-fangled dawn in gene editing. Life Sci, 2019. 232: p. 116636.1. Science Advances. (IF=13.116). Sun, et.al. (2020). Development of a CRISPR-SaCas9 system for projection- and function-specific gene editing in the rat brain.［北京大学 CRISPR-saCas9 基因编辑雄性SD大鼠特定神经元群］；2. Int. J. Mol. Sci. (IF=4.556). Xu, et al. (2020). Effective MSTN Gene Knockout by AdV-Delivered CRISPR/Cas9 in Postnatal Chick Leg Muscle.［上海交通大学 AdV-CRISPR system(pAdM-U6-gRNA1-U6-gRNA2-CMV-spCas9) 鸡胚成纤维细胞DF-1 MOI=1000 & 鸡肌肉注射 鸡骨骼肌的生长和发育］；3. Retrovirology. (IF=4.183). Wang, et.al. (2017). Genome modifcation of CXCR4 by Staphylococcus aureus Cas9 renders cells resistance to HIV-1 infection.［武汉大学基础医学院 AAV-SaCas9-CXCR4-gRNA HIV基因治疗］。
